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Jun 14, 2023

Estructura

Informes científicos volumen 6,

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 20798 (2016) Citar este artículo

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El conocimiento de la relación estructura-propiedad-función de las sustancias húmicas (SH) es clave para comprender su papel en el suelo. A pesar de los avances, los estudios sobre este tema aún están en discusión. Analizamos 37 fracciones húmicas con respecto a su composición isotópica, características estructurales y propiedades responsables de estimular los parámetros de la raíz de la planta. Mostramos que, independientemente de la fuente de origen del carbono (C3 o C4), los HS extraídos del suelo y los ácidos húmicos (HA) son estructuralmente similares entre sí. La fracción de HS más lábil y funcionalizada es responsable de la emisión de raíces, mientras que la fracción de HA más recalcitrante y menos funcionalizada está relacionada con el crecimiento de raíces. Las estructuras lábiles promueven la estimulación de la raíz a concentraciones más bajas, mientras que las estructuras recalcitrantes requieren concentraciones más altas para promover un estímulo similar. Estos hallazgos muestran que la labilidad y la recalcitrancia, que son propiedades derivadas de las fracciones húmicas, están relacionadas con el tipo e intensidad de su bioactividad. En resumen, la comparación de las fracciones húmicas permitió comprender mejor la relación entre la fuente de origen del carbono vegetal y la estructura, propiedades y tipo e intensidad de la bioactividad de los HS en las plantas. En este estudio se unifican conceptos científicos y se establecen las bases para el uso agronómico de los HS.

Las funciones de la materia orgánica disuelta (DOM) en los suelos, específicamente las sustancias húmicas (DOM-HSs), están bien establecidas1,2,3,4. Varios estudios muestran que los DOM-HS regulan los procesos metabólicos relacionados con el crecimiento de las plantas, especialmente la emisión y el crecimiento del sistema radicular5,6,7,8,9,10,11,12. La capacidad de los HS para desencadenar estímulos en el metabolismo de las plantas está directamente relacionada con su estructura. Los HS extraídos de suelos y con predominio estructural de los carbonos –CH3 y –COOH estimulan el metabolismo del carbono en plantas de Pinus nigra13, mientras que los carbonos pertenecientes a estructuras de lignina y grupos –COOH en los ácidos húmicos (HA) de vermicompost se correlacionan positivamente con la emisión de raíces laterales en plantas de maíz14.

Las propiedades relacionadas con la estructura de los HS también están relacionadas con su bioactividad. Los AH aislados de materiales compostados estructuralmente enriquecidos en grupos carboxilo (-COOH) y estructuras hidrofóbicas estimularon el crecimiento de raíces en plantas de maíz15, mientras que las estructuras hidrofóbicas en HS extraídos de vermicompost son responsables de estimular las bombas de protones en las raíces16. Zancani et al.17 demostraron que la multiplicación de células embriogénicas resulta de la hidrofilicidad y las conformaciones lábiles en ácidos fúlvicos extraídos del suelo, y García et al.18,19 demostraron que las estructuras alifáticas y oxigenadas en las HA de vermicompost están relacionadas con los efectos protectores sobre las plantas de arroz. sometidos a estrés hídrico.

Los estudios sobre la relación estructura-propiedad-función de los HS en las plantas son de gran importancia para comprender sus modos de acción y uso práctico. Este estudio tuvo como objetivo investigar la relación entre la estructura de las fracciones húmicas de suelos y materiales compostados y las propiedades que regulan y definen la bioactividad a nivel de raíces en plantas de arroz.

En este estudio se caracterizaron un total de 37 fracciones húmicas (HS, HA y Humins-Hus) derivadas de Histosols de diferentes fuentes y materiales compostados utilizando métodos isotópicos, químicos y espectroscópicos (análisis elemental, espectroscopia ultravioleta-visible [UV-vis], Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier [FTIR] y polarización cruzada de carbono-13: resonancia magnética nuclear con giro de ángulo mágico [13C-CP/MAS-NMR]). Se utilizaron métodos quimiométricos para relacionar las propiedades con los diferentes parámetros radiculares en las plantas. También discutimos la relación entre el tipo y la intensidad de la bioactividad de la planta y el origen del carbono de la planta, las características estructurales y las propiedades de recalcitrancia y labilidad.

Las fracciones húmicas del suelo presentaron el siguiente rango de aromaticidad: HA > HS > Hu. Las firmas espectrales de las fracciones húmicas corresponden a la presencia de carbono sp3 y sp2 (ver espectros incluidos en el Material complementario - SM, Fig. S1). Las características estructurales de las fracciones húmicas del suelo mostraron que los HA tienen una mayor predominancia de grupos C-alifáticos y C-aromáticos no sustituidos que las fracciones HS y Hu. Los HA tenían predominantemente grupos C-aromáticos no sustituidos y las propiedades aromáticas más llamativas entre las fracciones húmicas extraídas de materiales compostados (HA y HS).

Las características estructurales de las fracciones húmicas extraídas del suelo y las extraídas de los materiales compostados indicaron que los grupos C-alifáticos y C-aromáticos no sustituidos predominan en los HA del suelo. Sin embargo, los HA de vermicompost tenían características aromáticas más llamativas que las extraídas de los suelos. Se destacó un predominio promedio de grupos alifáticos C no sustituidos entre las fracciones de HS del suelo (ver Material complementario Tabla S1). Los datos espectrales de 13C-CP / MAS-NMR confirmaron esta observación en el análisis multivariante (Fig. 1, consulte el material complementario, Fig. S2). La gráfica del análisis de componentes principales (PCA) (73 % de la varianza total explicada) (ver Material complementario Fig. S1A) mostró una agrupación de diez de los trece HA estudiados con valores negativos en el PC1 (57 %), donde los HA extraídos de Se incluyeron materiales compostados. La figura S1-A1 (ver Material complementario) muestra un PCA con el 92% de la varianza total explicada en función del número relativo de tipos de carbonos de cada HA. Seis HA del suelo se agruparon en PC1 (60%) debido al predominio de estructuras C-alquil-O y C-alquilo, mientras que otras cinco HA se agruparon con valores negativos debido al predominio de grupos C-aromáticos. Los AH extraídos de materiales compostados estaban más relacionados con grupos C-aromáticos y C-alifáticos sustituidos.

(A,C) PCA realizado usando espectros puros. (B, D) PCA realizado a través de la integración de regiones de espectros puros.

Las fracciones de HS se distribuyeron en dos grupos en el PCA (76% de la varianza total explicada) de espectros puros (ver Material complementario, Fig. S1B). En contraste con el comportamiento de las fracciones de HA, seis fracciones de HS estaban más relacionadas con los grupos C-aromático y C-alifático no sustituidos en PC1 (72%). Las fracciones restantes de HS, incluidas las extraídas de materiales compostados, estaban estrechamente relacionadas con los grupos C-aromático y C-alifático sustituidos (consulte el material complementario Fig. S1-B1).

La fracción Hu mostró una distribución en el PCA con el 86 % de la varianza total, con PC1 (72 %) similar a la mostrada por los HA (ver material complementario, Fig. S1C). Cinco fracciones de Hu se agruparon y relacionaron con grupos C-alifáticos (valores positivos), mientras que las fracciones restantes se agruparon y relacionaron (valores negativos) con grupos C-aromáticos y C-alifáticos (PC1 72%).

La Figura 1A muestra el PCA (67% de la varianza total explicada) de espectros puros para las fracciones solubles HA y HS. Las fracciones de HA se agruparon en valores positivos, mientras que las fracciones de HS se agruparon con valores negativos en PC1 (50 %). Los AH extraídos de vermicompost y compost mostraron una relación más estrecha con las fracciones de HS extraídas del suelo. En el PCA de la Fig. 1B, PC1 (52 %) mostró que los HA del suelo estaban relacionados con grupos C-alifáticos y C-aromáticos no sustituidos, mientras que los HS, HS y HA del suelo de materiales compostados estaban relacionados con los grupos C-alifáticos y C-aromáticos más funcionalizados. Grupos C-aromáticos. El PCA (71% de la varianza total explicada) en la Fig. 1C muestra las tres fracciones estudiadas. Cinco fracciones Hu y tres fracciones HA se agruparon con valores positivos en PC1 (51%), mientras que las tres fracciones (HS, HA y Hu) se relacionaron con valores negativos. El PCA resumido en la Fig. 1D (86% de la varianza total explicada) muestra un clúster en PC1 (50%), con valores positivos de Hus y HAs con el mismo origen y estrechamente relacionados con grupos C-alifáticos no sustituidos. Otro grupo Hu estaba agrupado con los HS, con valores positivos en PC1 y estrechamente relacionado con los grupos funcionalizados con C.

Los HS mostraron obstinación como resultado de los grupos C-aromático y C-alifático no sustituidos y labilidad que resulta principalmente de los grupos C-alifáticos (C-alquil O, N y C-alquil-O) sustituidos y C de grupos carboxilo (Fig. 2A) . Por el contrario, la obstinación de los HA no solo resultó de los grupos C-aromáticos y C-alifáticos no sustituidos, sino que también mostró la contribución de C de los grupos carboxilo, mientras que la labilidad resultó de los grupos C-alifáticos y C-aromáticos no sustituidos (Fig. 2B) . Los patrones de recalcitrancia y labilidad de Hus fueron significativamente menos evidentes porque la mayor contribución a la recalcitrancia provino tanto de los grupos C-aromáticos como de las estructuras alifáticas sustituidas y el C carboxílico. A su vez, la mayor contribución a la labilidad resultó de los grupos C-alifáticos sustituidos y no sustituidos. y del carboxílico C (Fig. 2C).

(A) MCR de HS, (B) MCR de HA y (C) MCR de Hus.

Las cuantificaciones de labilidad y recalcitrancia (%) corroboraron las diferencias observadas en el MCR de las fracciones húmicas (Fig. 2D,E,F). Los HS extraídos del suelo mostraron ~56 % de labilidad y ~24 % de recalcitrancia, mientras que los HA mostraron ~47 % de labilidad y ~39 % de recalcitrancia, y Hus mostró 67 % de labilidad y 32 % de recalcitrancia. Las fracciones presentaron el siguiente ranking de recalcitrancia: HA > Hu > HS.

Las características espectrales de las fracciones húmicas mostraron la presencia de grupos funcionales de diferente naturaleza química (ver espectros incluidos en Material complementario, Fig. S2). La Figura S4 (ver Material complementario) muestra el PCA (89% de la varianza total explicada) para la fracción HA. Nueve HA se agruparon con valores positivos en PC1 (79%) y cuatro con valores negativos. A diferencia de los PCA realizados con espectros de 13C-NMR, los HA derivados de materiales compostados no mostraron similitudes en términos de grupos funcionales en este análisis (consulte el material complementario, Fig. S4-A). El PCA (75% de la varianza total explicada) para las fracciones HS mostró una clara separación de estas fracciones en dos grupos: siete fracciones HS agrupadas con valores positivos en PC1 (56%) y seis con valores negativos. Los HS derivados de materiales compostados tampoco mostraron similitudes en términos de grupos funcionales (ver Material complementario Fig. S4-B). El PCA (86% de la varianza total explicada) también mostró que los Hus se distribuyeron en dos grupos en PC1 (65%). Seis Hus se agruparon con valores positivos y cinco con valores negativos (consulte el material complementario, Fig. S4-C).

La comparación entre las fracciones HA y HS en PCA (92% de la varianza total explicada) mostró una clara separación de estas fracciones en PC1 (85%) (Fig. 3A). HSs y HAs mostraron fuertes diferencias en términos de grupos funcionales. Los HS se agruparon con valores positivos en PC1, mientras que los HA se agruparon con valores negativos. Los PCA de las tres fracciones (80% de la varianza total explicada) mostraron que los Hus eran similares a los HAs en términos de grupos funcionales, agrupándose en estrecha relación en PC1 (50%).

(A) fracciones solubles, HAs y HS. (B) tres fracciones, HAs, HS y Hu.

Las composiciones isotópicas de δ13C fueron similares en las tres fracciones húmicas extraídas del suelo (consulte el material complementario, Tabla S2). En general, estas fracciones húmicas tenían composiciones isotópicas entre -20% y -30%, mientras que las fracciones aisladas de materiales compostados tenían composiciones entre -14% y -16%. Esta composición isotópica mostró que el carbono vegetal de las fracciones húmicas del suelo probablemente se derivó de las plantas de la vía fotosintética C3, mientras que el carbono de las fracciones húmicas de los materiales compostados se derivó de las plantas C420 (consulte el material complementario Tabla S2).

Las fracciones de HS extraídas de materiales compostados tuvieron valores de C más altos que las extraídas de Histosoles, mientras que HS_VCF tuvo mayores cantidades de N. La relación H/C fue menor en los HS extraídos de materiales compostados, ν fue ligeramente mayor en HS_CCF y δ fue ligeramente superior en HS_VCF que en HS extraídos del suelo. Las fracciones HS_CCF y HS_VCF tuvieron relaciones E4/E6 más bajas.

Las HA extraídas de materiales compostados tenían niveles más altos de C y N que las de las HA extraídas del suelo. La fracción HA_CCF presentó los niveles más altos de O, una relación O/C más alta y un valor de ω más alto, mientras que HA_VCF mostró los valores más altos de δ y la relación E4/E6.

La Figura 4 muestra cómo se relacionaron los elementos con cada fracción húmica soluble (Fig. 4A) y entre las tres fracciones húmicas (Fig. 4B). El PCA (67,02% de la varianza total explicada) realizado con las fracciones HS y HA indicó la existencia de una relación entre los HSs y los parámetros asociados a la oxigenación/funcionalización (O, O/C y ω), con valores positivos de PC1 (41,25%) y una relación con los parámetros C/N y E4/E6 ratios, C y δ. A su vez, los HAs mostraron relación con los parámetros relacionados con la saturación de enlaces (H, H/C), ν y contenido de N.

(A) fracciones solubles, HAs y HS. (B) tres fracciones, HAs, HS y Hu.

El PCA (79,41 % de la varianza total explicada) realizado con las tres fracciones (Fig. 4B) mostró que las fracciones solubles de HS y HA se agruparon con valores positivos en PC1 (54,96 %) con todos los elementos presentes (C, H, N , O) y con los parámetros ω, ν y E4/E6. Hus se agrupó de forma independiente con valores negativos en PC1, mostrando una relación con los parámetros C/N, H/C y δ.

Los efectos ejercidos por las fracciones húmicas de HS y HA en el sistema de raíces de las plantas de arroz se muestran en la Fig. S3 (ver Material complementario). Las concentraciones más prometedoras de HS estimularon los parámetros de la raíz en el rango de 1,5 a 5,0 mg (C). L−1, mientras que los HA ejercieron estímulo a concentraciones mayores de 5,0 y 10,0 mg (C). L−1.

Cifra. 5A,B muestran los PCA que relacionan las fracciones húmicas con los parámetros de la raíz, los tipos de carbono en 13C-CP/MAS-NMR y la composición elemental. El PCA en la Fig. 5A (68,35% de la varianza total explicada) muestra una agrupación de fracciones HS con valores positivos y fracciones HA con valores negativos en PC1. La fracción de HS extraídos de suelos y materiales compostados mostró una estrecha relación (estímulo) con los parámetros radiculares correspondientes al área superficial (S.Area), longitud de la radícula (Longitud) y raíces más pequeñas (0.5 < T < 1.5, 0.5 < L < 1,5, T y L son el número de raíces y las raíces con longitudes entre 0,5 y 1,5, respectivamente). Estos estímulos también estaban estrechamente relacionados con los grupos alifáticos C sustituidos (C-Alk [O, N], C-Alk-O) y carboxílicos C-COOH y la alifaticidad. La fracción de HA extraída de suelos y materiales compostados mostró una relación con los parámetros de raíz diámetro (D), número de raíces (raíces) y raíces más grandes (1.5 < T < 3.5, 1.5 < L < 3.5, L > 3.5, T > 3.5). Estos estímulos estaban estrechamente relacionados con los grupos C-alifático sustituido (C-Alk [di-O]), C-alifático no sustituido (C-Alk), C-aromático y carbonilo CC = O y con la aromaticidad.

PCA mostrando la relación entre los datos resultantes de la cuantificación de tipos de carbono a partir de los espectros 13C-CP/MAS-NMR (A) y el análisis elemental (B) de fracciones húmicas (HSs y HAs), y los parámetros de raíz evaluados en plantas de arroz

La Figura 5B muestra el PCA (50,45 % de la varianza total explicada) para los datos de composición elemental y los parámetros de bioactividad de la raíz. Las fracciones de HS y HA extraídas de los materiales compostados se agruparon con valores negativos, y los AH extraídos del suelo se agruparon con valores negativos en PC1 (31,97 %). Las fracciones de HS y HA extraídas de los materiales compostados mostraron estrechas relaciones (estímulos) con el área de superficie radicular, longitud radicular, número de raíces y raíces de menor tamaño y diámetro (0.5 < T < 1.5, 0.5 < L < 1.5); a su vez, estos parámetros se relacionaron con los niveles de C y O, las relaciones C/N y O/C, las propiedades E4/E6 y la densidad aparente (d). Los HA extraídos del suelo se relacionaron con el número de raíces más grandes y el diámetro de la raíz (Diam); a su vez, estos parámetros se relacionaron con los niveles de H y C, la relación H/C y el volumen aparente (v).

La Figura 6 muestra la regresión de componentes principales (PCR) entre los datos espectrales y los parámetros de actividad biológica en el sistema radicular. La PCR realizada entre 13C-NMR y los parámetros de raíz con respecto a las fracciones de HA (Fig. 6A) reveló que los tipos de carbono que se correlacionaron positivamente con los parámetros de raíz fueron C-alifático no sustituido, C-aromático no sustituido y C carboxílico. La PCR para las fracciones de HS (Fig. 6C) mostró que los tipos de carbono que se correlacionaron positivamente con los parámetros de la raíz fueron C-alifático sustituido, C-aromático sustituido y C carboxílico.

(A, B) Ácidos húmicos (HAs) y (C,D) Sustancias húmicas (HS).

La figura 6B muestra la PCR realizada con los datos FTIR de los HA y los parámetros de raíz. Los grupos funcionales correlacionados positivamente con los parámetros de la raíz fueron las vibraciones de estiramiento –OH, –CH, C = O, C = C, CH aromático y C–O. La PCR realizada con los datos de HS reveló que la mayoría de los grupos funcionales en la región espectral se correlacionaron positivamente con los parámetros de la raíz (las vibraciones de estiramiento –OH, –CH, C = O, C = C, CH aromático y alcoholes C–O y polisacáridos ) (Fig. 6D).

El tipo de material vegetal que originó las fracciones húmicas no tuvo efecto sobre el tipo de estructura. Los HS del suelo derivados del carbono vegetal C3 desarrollan una estructura similar a los HS de los materiales compostados derivados del carbono vegetal C4, y se observa la misma tendencia para la fracción HA.

La fracción HA extraída de Histosols y materiales compostados es predominantemente aromática y alifática, con baja funcionalización química (sustitución por O y N), mientras que la fracción HS consiste predominantemente en estructuras funcionalizadas (ver Material complementario Fig. 1B y Tabla S2). Estas características estructurales indican que la fracción HSs es más lábil que la fracción HA y que la fracción HA tiene compuestos esencialmente recalcitrantes (Fig. 2). La fracción Hu no mostró características estructurales específicas que la diferenciaran de la fracción HA. El PCA-FTIR mostró una estrecha relación entre esta fracción y la fracción HA, indicando que sus propiedades de labilidad y recalcitrancia eran menos evidentes. Estos resultados confirman estudios previos sobre la relación entre Hus y HAs21,22,23.

Los HS extraídos tanto de suelos como de materiales compostados mostraron similitudes en sus características estructurales. Este hallazgo indica que los HS producen estructuras húmicas similares, independientemente de su fuente de origen, lo que no se observó para los AH. Los HA extraídos de materiales compostados mostraron una mayor similitud estructural con las fracciones de HS que con las fracciones de HA extraídas del suelo. Estos resultados indican que los mayores cambios estructurales ocurren cuando se realiza el fraccionamiento químico utilizando la fracción HSs.

En resumen, las diferencias estructurales entre la fracción HSs y las fracciones HA (fracciones solubles) no están relacionadas con la presencia de estructuras (ver Material complementario Fig. S1) sino con su conformación y/u organización estructural. Estos resultados refuerzan la interpretación estructural de las fracciones húmicas como supramoléculas, según lo informado por Nebiosso & Piccolo24,25. La interpretación clásica de la fracción Hu como fracción independiente era menos evidente. Por el contrario, el Hus presentó menor aromaticidad y complejidad estructural, tal como lo reportan los estudios de Hayes et al.23 y Nebbioso et al.22. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que la fracción Hu es similar a la fracción HA pero que ya formó enlaces con la fracción mineral del suelo, lo que explicaría su baja solubilidad22.

Por primera vez, este estudio muestra que la obstinación y labilidad de las fracciones húmicas son propiedades químicas que definen la estimulación de los parámetros radiculares de las plantas. La longitud de la raíz y la emisión de raíces más pequeñas están relacionadas con estructuras menos complejas y funcionalizadas (cadenas alifáticas funcionalizadas con -O, -N) (Fig. 5A) y proporciones E4/E6 más altas (Fig. 5B), y estas estructuras son responsables de estructural labilidad Por el contrario, el crecimiento de raíces más grandes está relacionado con estructuras más complejas y menor funcionalización química (grupos aromáticos y alifáticos no sustituidos) (Fig. 5A). El análisis de PCR confirmó esta relación porque el patrón espectral registrado para las estructuras que se correlacionó positivamente con el estímulo de la raíz en los HS se corresponde con el patrón de labilidad registrado en estas sustancias. Por lo tanto, el patrón espectral registrado para las estructuras que se correlacionó positivamente con el estímulo de la raíz en los HA está relacionado con el patrón de obstinación registrado para esta fracción (Fig. 6).

La relación entre recalcitrancia y labilidad también definió el nivel máximo de bioactividad en cada fracción húmica. La fracción HA estimuló los parámetros de la raíz de la planta en concentraciones (5,0–10,0 mg (C) L−1) cinco veces más altas que las concentraciones de estímulo para HS (1,5–2,5 mg (C) L−1). Esta relación entre obstinación y labilidad era aún más evidente al analizar la misma fracción. Las fracciones de HS más lábiles (HS_RJ, HS_SP, HS_RN, HS_RJ4, HS_RJ3, HS_RJ2) promovieron la estimulación de raíces en concentraciones más bajas (1.5 mg [C] L−1), mientras que las fracciones más recalcitrantes requirieron concentraciones más altas para promover un estímulo similar. La misma tendencia se observó en las fracciones de HA.

Los resultados de este estudio sobre la acción de los HS en el crecimiento y desarrollo de las raíces de las plantas se explican en otros estudios que muestran estos efectos. Por ejemplo, efectos tipo auxina (efectos hormonales) que están bien establecidos y probados en la literatura pueden explicar este tipo de acción de los HS sobre el sistema radicular26,27, así como los efectos nutricionales que muestran los HS sobre la captación de NO3− y Metabolismo del Fe28,29.

Por último, este estudio demuestra que la fuente de material vegetal (C3 o C4) no tuvo un efecto claro sobre las características estructurales de las fracciones húmicas, que son similares entre sí. Sin embargo, las propiedades generadas a partir de estas estructuras son diferentes. Así, se puede concluir que sus principales diferencias radican en su organización estructural, lo que puede entenderse como supramolecularidad. La supramolecularidad de las fracciones húmicas, que involucra la interacción entre moléculas y la reorganización espacial24,25, es una característica estructural de las fracciones húmicas que es capaz de definir propiedades como la recalcitrancia y labilidad. Simultáneamente, estas propiedades definen el tipo y magnitud de la bioactividad de la planta. Así, se establece y prueba la relación estructura-propiedad-función de las fracciones húmicas estudiadas.

Los suelos seleccionados para preparar las fracciones húmicas se clasifican como Histosoles30 (ver las características de los suelos en el Material complementario—Tabla S3). Las muestras de suelo fueron recolectadas en los horizontes hísticos (0,00–0,40 m) de siete estados brasileños (Rio de Janeiro, Brasilia-DF (Distrito Federal), Mato Grosso do Sul, São Paulo, Paraíba, Rio Grande do Norte, Ceará) con variaciones de temperatura, humedad y precipitaciones31,32. Las fracciones húmicas se prepararon a partir de materiales compostados resultantes de un vermicompost producido utilizando estiércol de ganado y pasto elefante (Pennisetum purpureum) como materias primas (ver las características de los materiales en el Material complementario—Tabla S4).

La nomenclatura utilizada para las diferentes fracciones húmicas fue la siguiente. Sustancias húmicas: (Río de Janeiro: HS_RJ, HS_RJ2, HS_RJ3 y HS_RJ4; Brasilia-DF: HS_DF; Mato Grosso do Sul: HS_MS; São Paulo: HS_SP; Paraíba: HS_PB; Rio Grande do Norte: HS_RN; Ceará: HS_CE, HS_C2 ; Vermicompost: HS_VCF; Compost: HS_CCF). Ácidos húmicos: (Río de Janeiro: HA_RJ, HA_RJ2, HA_RJ3 y HA_RJ4; Brasilia-DF: HA_DF; Mato Grosso do Sul: HA_MS; São Paulo: HA_SP; Paraíba: HA_PB; Rio Grande do Norte: HA_RN; Ceará: HA_CE, HA_C2 ; Vermicompost: HA_VCF; Compost: HA_CCF). Humins: (Río de Janeiro: Hu_RJ, Hu_RJ2, Hu_RJ3 y Hu_RJ4; Brasilia-DF: Hu_DF; Mato Grosso do Sul: Hu_MS; São Paulo: Hu_SP; Paraíba: Hu_PB; y Rio Grande do Norte: Hu_RN; Ceará: Hu_CE, Hu_C2 ).

La extracción y purificación de las fracciones húmicas –sustancias húmicas (HSs) y ácidos húmicos (HAs)– se realizaron siguiendo el método de la International Humic Substances Society (IHSS) y según el protocolo informado por Swift33. Se adoptó una modificación inicial que consistió en pretratar las muestras de suelo con una solución de HCl (0.1 mol L−1), pH 1.0–2.034,35. Las huminas (Hu) se obtuvieron y purificaron mediante el procedimiento descrito por Nebiosso et al.36 con modificaciones. Estos procedimientos se describen en detalle en los Materiales complementarios.

La abundancia isotópica de 13C (δ13C) se evaluó en las muestras de fracciones húmicas extraídas de suelos y materiales compostados utilizando muestras de 200 a 400 μg y un analizador automático C–N Carlo Erba (EA 1108, Milán, Italia) acoplado a un analizador continuo. espectrómetro de masas de relación isotópica de flujo (Finnigan Mat, Bremen, Alemania). Los resultados se expresan como δ13C (%) utilizando Pee Dee Belemnite (PDB) como estándar de referencia para el carbono.

El análisis elemental se obtuvo usando un analizador elemental Perkin Elmer 2400 CHN. Los análisis se realizaron utilizando 1,1 ± 0,1 mg de muestras pesadas en una microbalanza acoplada al dispositivo. El patrón de referencia utilizado fue la acetanilida (C: 71,09 %; H: 6,71 %; N: 10,36 %). El grado de oxidación interna (Wi) y la densidad de la fracción húmica se determinaron según Orlov37. El análisis de HSs y HAs se realizó mediante espectroscopia ultravioleta-visible (UV-vis), y los espectros se registraron según Canellas38. Los espectros UV-vis se registraron en un rango espectral de 200 a 800 nm. La absorbancia a 465 nm se dividió por el valor medido a 665 nm para determinar el coeficiente de relación E4/E6.

Los espectros en la región infrarroja se registraron en el rango de 4.000–400 cm−1 en un espectrómetro infrarrojo (FT-IR) NICOLET, modelo 6700, con transformada de Fourier (FTIR), utilizando gránulos de KBr (5 mg de HA liofilizado + 200 mg de KBr).

La espectroscopia 13C-CP/MAS-NMR se realizó utilizando un dispositivo Bruker AVANCE II NMR a 400 MHz, equipado con una sonda Narrow MAS de 4 mm y operando en una secuencia de resonancia magnética 13C a 100,163 MHz. Los espectros se dividieron en desplazamientos químicos; las áreas se determinaron después de la integración de cada región y se expresan como porcentajes del área total. Las regiones se asignaron de la siguiente manera: alquilo C (CAlq-H,R): 0–45 ppm; metoxilo y N–alquilo C (CAlq-O,N): 45–60 ppm; O–alquilo C (CAlq-O): 60–91 ppm; di–O–alquilo C (anomérico) (CAlq-di-O): 91–110 ppm; C aromático (CAr-H,R): 110–142 ppm; O–C aromático (CAr-O): 142–156 ppm; carboxilo C (CCOO-H,R): 156–186 ppm y carbonilo C (CC = O): 186–230 ppm.

Los experimentos de bioactividad de HSs y HAs en plantas de arroz (Oryza sativa L.) se realizaron utilizando la variedad de arroz Piauí. Las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento con las siguientes condiciones: ciclo de luz: 12/12 h (luz/oscuridad), flujo de fotones fotosintéticos: 250 μmol m−2s−1, humedad relativa: 70 % y temperatura: 28 °C /24 °C (día/noche). Las semillas de arroz se desinfectaron previamente con hipoclorito de sodio (2%) durante 10 minutos y posteriormente se lavaron con agua destilada. Cuatro días después de la germinación de las semillas, las plántulas se trataron con una solución Hoagland39 modificada a ¼ de la fuerza iónica total (pH = 5,5). Tres días después, la solución de Hoagland se reemplazó con una solución con la mitad de la fuerza iónica total y esta solución se repuso durante todo el experimento. El diseño experimental utilizado en todos los experimentos fue un diseño completamente al azar, utilizando un total de cinco plantas por maceta y cinco repeticiones por tratamiento.

Se realizaron experimentos preliminares para probar un rango de concentraciones (0.5, 1.5, 2.5, 5.0 y 10.0 mg [C-HA/HS] L−1) (ver Material complementario Fig. S6) para determinar las concentraciones con las respuestas más prometedoras en estimulando los sistemas radiculares de las plantas de arroz. Las plantas de arroz se pusieron en contacto con las soluciones nutritivas que contenían los HA y HS disueltos. Las plantas se retiraron para evaluar los parámetros de la raíz después de completar diez días de crecimiento después del trasplante (días después del trasplante-DAT). Se realizaron nuevos experimentos para evaluar la respuesta de los sistemas de raíces de las plantas de arroz a las fracciones húmicas solubles con base en los resultados del experimento anterior, en el que se aplicaron las concentraciones de HA y HS que promovieron el mayor número de raíces.

Se utilizó un sistema de escaneo Epson Expression 10000XL con una unidad de luz adicional (Unidad Turbo Pascal, TPU). Se analizaron y cuantificaron cuatro características diferentes de las raíces: longitud (mm), área de superficie (mm2), diámetro medio (mm) y número de raíces. La longitud (mm) y el número de raíces se definieron y midieron utilizando las clases superfina (0,5–1,5 mm), fina (1,5–3,5 mm) y gruesa (>3,5 mm) con el software WinRhizo Arabidopsis, 2012b (Régent Instruments, Inc., Quebec, Canada).

Los análisis de componentes principales (PCA), la resolución de la curva multivariante (MCR) y la regresión de componentes principales (PCR) utilizando los datos espectrales de 13C-CP/MAS-NMR y FTIR de las fracciones húmicas se realizaron utilizando el paquete de software Unscrambler® X 10.3 (Camo Software AS Inc., Oslo, Noruega). Los espectros de 13C-NMR y FTIR de las fracciones húmicas se cargaron usando el software y se normalizaron en área. El rango seleccionado para conformar la matriz de datos espectrales de 13C-NMR fue de -20 ppm a 240 ppm. Los valores fuera de este rango fueron descartados para evitar contribuciones falsas a los análisis. El PCA de cada fracción húmica se realizó mediante un algoritmo de mínimos cuadrados parciales iterativos no lineales (NIPALS) y el método CROSS VALIDATION con un máximo de siete componentes. Se seleccionó el rango de 400 cm−1 a 3800 cm−1 para el FTIR PCA. Las condiciones de análisis fueron las mismas que las utilizadas para 13C-NMR. La labilidad y la recalcitrancia (%) se cuantificaron en función de la concentración de los componentes. Los análisis de PCR se realizaron con los datos de FTIR y 13C-NMR utilizando los parámetros de bioactividad normalizados evaluados como variable predictora X según Khattree y Naik35. Los datos espectrales se usaron como variable predictora Y. Se usaron un máximo de siete componentes principales para un nivel de confianza del 95%. Se utilizó el algoritmo NIPALS y la validación de corrección de apalancamiento.

Los análisis multivariados sin involucrar la carga de datos espectrales (PCA de la composición elemental de las fracciones húmicas y PCA de los parámetros de raíz evaluados en los experimentos de bioactividad) se realizaron utilizando el paquete Statgraphics® Centurion XVI (StatPoint Technologies, Inc. 560 Broadview Ave # 201, Warrenton , VA 20186, EE. UU.). Los datos se cargaron en Statgraphics® y los análisis se realizaron con los datos homogeneizados utilizando sus desviaciones estándar40. Los parámetros evaluados fueron seleccionados en ambos análisis, y las muestras de fracciones húmicas fueron seleccionadas como niveles de puntos. Se seleccionó un máximo de diez componentes y un tipo de gráfico bi-plot para la representación gráfica.

Cómo citar este artículo: García, AC et al. Relación Estructura-Propiedad-Función en Sustancias Húmicas para Explicar la Actividad Biológica en las Plantas. ciencia Rep. 6, 20798; doi: 10.1038/srep20798 (2016).

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ACG agradece al CNPq-CAPES por la beca PDJ y el financiamiento a través del proyecto Ciencia sin Fronteras-PVE A060/2013. Los autores agradecen al proyecto CAPES-MES N° 46/2013, 215/13. Los autores agradecen a Universal/CNPq y FAPERJ (APQ1).

Universidad Federal Rural de Río de Janeiro, Departamento de Ciencias del Suelo, Rodovia BR 465 km 7, Seropédica, CEP 23890-000, RJ, Brasil

Andrés Calderín García, Luiz Gilberto Ambrosio de Souza, Marcos Gervasio Pereira, Everaldo Zonta, Francy Junior Gonçalves Lisboa & Ricardo Luis Louro Berbara

Departamento de Química, Universidad Federal Rural de Río de Janeiro, Rodovia BR 465 km 7, Seropédica, CEP 23890-000, RJ, Brasil

rosane nora castro

Departamento de Biología Ambiental, Grupo de Química y Biología Agrícola-CMI Roullier, Facultad de Ciencias, Universidad de Navarra, Pamplona, ​​Navarra 31008, España.,

José María García-Mina

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ACG escribió el manuscrito, diseñó el estudio y realizó partes de los experimentos. RLLB escribió el manuscrito y realizó el estudio quimiométrico. LGAdS realizó los experimentos de cuantificación isotópica. RNC realizó la caracterización espectroscópica. MGP recolectó las muestras de suelo y diseñó parte del estudio. JMGM diseñó los experimentos sobre la bioactividad en plantas. EZ diseñó y ejecutó los experimentos de bioactividad relacionados con las raíces de las plantas. FJGL contribuido al diseño experimental, interpretación de datos y redacción del manuscrito.

Correspondence to Andrés Calderín García.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

García, A., de Souza, L., Pereira, M. et al. Relación Estructura-Propiedad-Función en Sustancias Húmicas para Explicar la Actividad Biológica en las Plantas. Informe científico 6, 20798 (2016). https://doi.org/10.1038/srep20798

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Recibido: 28 Agosto 2015

Aceptado: 12 de enero de 2016

Publicado: 10 febrero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep20798

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